試劑(ji)的(de)本源在于蛋白質(zhi)(zhi)，穩定(ding)性還(huan)是在于蛋白質(zhi)(zhi)的(de)有(you)無(wu)變化。下面將一(yi)一(yi)介紹蛋白質(zhi)(zhi)的(de)注意事項。

一、蛋白質失活的原因

在各(ge)(ge)種條件(jian)下使(shi)用不同(tong)操(cao)作(zuo)(zuo)(zuo)方法從(cong)細胞(bao)環境中(zhong)提取(qu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)將會導致(zhi)其(qi)活(huo)(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)丟失(shi)和結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)改(gai)(gai)變。這些操(cao)作(zuo)(zuo)(zuo)包括稀(xi)釋，改(gai)(gai)變溶液條件(jian)，暴露于各(ge)(ge)種降解酶、氧氣、重金屬及各(ge)(ge)種材，的(de)(de)(de)(de)(de)表面，以及生(sheng)(sheng)理條件(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)變化 (如(ru)(ru)凍融作(zuo)(zuo)(zuo)用) 等。意識到這其(qi)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)任何—個(ge)(ge)情(qing)況都有可能(neng)(neng)(neng)影響蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)、了解可能(neng)(neng)(neng)采取(qu)的(de)(de)(de)(de)(de)盡量減少(shao)這些影響的(de)(de)(de)(de)(de)預防措(cuo)施(shi)，都將有助(zhu)于確保一個(ge)(ge)純(chun)化草案(an)的(de)(de)(de)(de)(de)成功(gong)。如(ru)(ru)果在任何操(cao)作(zuo)(zuo)(zuo)過程(cheng)中(zhong)發(fa)生(sheng)(sheng)目標蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)丟失(shi)或(huo)失(shi)活(huo)(huo)，那(nei)么(me)在確定這種情(qing)況發(fa)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)原因(yin)時將通常會提出(chu)一個(ge)(ge)簡(jian)單(dan)的(de)(de)(de)(de)(de)解決(jue)(jue)方案(an)。因(yin)此，如(ru)(ru)果可能(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)話，檢(jian)查蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)失(shi)活(huo)(huo)是(shi)(shi)(shi)否伴隨著蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)損失(shi)或(huo)其(qi)結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)變化，或(huo)者是(shi)(shi)(shi)否蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)仍(reng)然存在，但已失(shi)活(huo)(huo)。這些不同(tong)可能(neng)(neng)(neng)性(xing)之間的(de)(de)(de)(de)(de)區別可能(neng)(neng)(neng)表明了什(shen)么(me)類型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)操(cao)作(zuo)(zuo)(zuo)過程(cheng)是(shi)(shi)(shi)失(shi)活(huo)(huo)背(bei)后的(de)(de)(de)(de)(de)問題，因(yin)此也指明了一個(ge)(ge)適當的(de)(de)(de)(de)(de)解決(jue)(jue)方案(an)是(shi)(shi)(shi)什(shen)么(me)。

二、常規處理方法

顯然，要保持蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)穩定，應(ying)避免可(ke)(ke)以(yi)使(shi)其變性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)處理方法。因此，蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液(ye)一般不(bu)要劇烈攪拌或(huo)渦旋，因為這(zhe)可(ke)(ke)能會導致蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)氧化或(huo)表面變性(xing)(xing)。蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液(ye)不(bu)應(ying)暴露于極端的(de)(de)(de)(de)(de) pH、高溫、有機溶(rong)劑或(huo)任(ren)何(he)其他可(ke)(ke)能促進變性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)條件(jian)。同樣(yang)(yang)，如(ru)果在解凍(dong)的(de)(de)(de)(de)(de)狀態下長時間儲(chu)(chu)存(cun)一種蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液(ye)，細(xi)菌和真菌的(de)(de)(de)(de)(de)生長將會成為一個問題。在這(zhe)樣(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下，無(wu)菌溶(rong)液(ye)和抗(kang)菌或(huo)抗(kang)真菌試劑可(ke)(ke)能是必要的(de)(de)(de)(de)(de)。最后，最好(hao)使(shi)用蒸餾水配制將與蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)接(jie)觸的(de)(de)(de)(de)(de)所有溶(rong)液(ye)，并且(qie)要將蒸餾水儲(chu)(chu)存(cun)在無(wu)藻類生長的(de)(de)(de)(de)(de)容(rong)器(qi)中。

三、濃縮和溶劑條件

從細胞(bao)中(zhong)提取蛋(dan)白質(zhi)(zhi)不可(ke)避(bi)免(mian)地導致(zhi)其(qi)所在環境的(de)(de)(de)(de)(de)改變(bian)。由于蛋(dan)白質(zhi)(zhi)在體內(nei)一(yi)(yi)般是穩(wen)定的(de)(de)(de)(de)(de)，理(li)論上的(de)(de)(de)(de)(de)目標(biao)是嘗(chang)試去(qu)復制盡可(ke)能(neng)接近于細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)環境，這(zhe)(zhe)就意味著高(gao)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)度、接近中(zhong)性的(de)(de)(de)(de)(de) PH、適中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)離(li)子強(qiang)度、還原狀(zhuang)態的(de)(de)(de)(de)(de)條(tiao)(tiao)件等。實(shi)際上，這(zhe)(zhe)些(xie)條(tiao)(tiao)件中(zhong)有些(xie)是與蛋(dan)白質(zhi)(zhi)純(chun)(chun)(chun)化相一(yi)(yi)致(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)，有些(xie)則不是。如前所述，保持高(gao)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)度 OlmgZmL) 通(tong)(tong)常(chang)是一(yi)(yi)個很好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)做法。這(zhe)(zhe)將(jiang)(jiang)有助于保持蛋(dan)白質(zhi)(zhi)復合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)狀(zhuang)態，可(ke)最大限(xian)度地減少有害污染(ran)物(wu)和表面吸附作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響，而且為目標(biao)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)提供一(yi)(yi)個普遍穩(wen)定的(de)(de)(de)(de)(de)環境。在蛋(dan)白質(zhi)(zhi)純(chun)(chun)(chun)化的(de)(de)(de)(de)(de)早期保持高(gao)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)度是相對比(bi)較(jiao)容易的(de)(de)(de)(de)(de)，但隨著蛋(dan)白質(zhi)(zhi)純(chun)(chun)(chun)化的(de)(de)(de)(de)(de)進(jin)行(xing)，這(zhe)(zhe)將(jiang)(jiang)變(bian)得(de)更加困難(nan)，除非在每(mei)個純(chun)(chun)(chun)化步(bu)(bu)驟之后都(dou)進(jin)行(xing)一(yi)(yi)次(ci)濃(nong)(nong)縮(suo)(suo)。因(yin)為這(zhe)(zhe)些(xie)后期的(de)(de)(de)(de)(de)過程通(tong)(tong)常(chang)也存在自身的(de)(de)(de)(de)(de)問題(ti)，所以除非特殊的(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)定性問題(ti)變(bian)得(de)很明顯，否則在大多(duo)情況下(xia)，你(ni)可(ke)能(neng)不得(de)不接受稀(xi)(xi)溶(rong)液。將(jiang)(jiang)濃(nong)(nong)縮(suo)(suo)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)(chun)化步(bu)(bu)驟與稀(xi)(xi)釋蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)(chun)化步(bu)(bu)驟進(jin)行(xing)交替的(de)(de)(de)(de)(de)做法可(ke)能(neng)是有用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)。例(li)如，將(jiang)(jiang)結合(he)(he)到層析柱上的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)進(jin)行(xing)一(yi)(yi)次(ci)性洗脫的(de)(de)(de)(de)(de)操作往(wang)往(wang)會(hui)(hui)使(shi)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)縮(suo)(suo)，而梯度洗脫則趨(qu)向(xiang)于將(jiang)(jiang)其(qi)稀(xi)(xi)釋。使(shi)用(yong)結合(he)(he)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)層析柱進(jin)行(xing)純(chun)(chun)(chun)化趨(qu)向(xiang)于濃(nong)(nong)縮(suo)(suo), 而凝膠過濾則會(hui)(hui)稀(xi)(xi)釋。通(tong)(tong)過明智(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)安排純(chun)(chun)(chun)化步(bu)(bu)驟，可(ke)能(neng)會(hui)(hui)避(bi)免(mian)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)溶(rong)液被過多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)稀(xi)(xi)釋。

溶(rong)液的(de)條件也(ye)是極其(qi)重要的(de)。雖然(ran)不(bu)(bu)可能(neng)(neng)描述出(chu)適用于(yu)每一個蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)一種通用穩定溶(rong)液的(de)配制(zhi)方法，但對于(yu)某種蛋(dan)白質(zhi)(zhi)來說(shuo)，添加特(te)(te)定的(de)組分通常是有(you)(you)用的(de)。這些條件包括(kuo)能(neng)(neng)夠避免不(bu)(bu)必要的(de) pH 變化的(de)緩沖體系，體系的(de) PH 通常在中性(xing)附(fu)近。應(ying)該特(te)(te)別注意緩沖液的(de)陰離子(zi)，因(yin)為很多情況下 Cr 可能(neng)(neng)是有(you)(you)害的(de)。EDTA 通(tong)常以(yi)約 0.Immol/L 的濃(nong)度添加(jia)，用(yong)(yong)以(yi)螯(ao)合可能與蛋白質相互作用(yong)(yong)或促進氧(yang)化的重金(jin)屬(shu)離子。還原劑(ji)（如 2-疏(shu)基乙醇或二(er)硫蘇糖醇) 通(tong)常用(yong)(yong)于對(dui)抗氧(yang)化作用(yong)(yong)，尤其是半胱氨酸殘基的氧(yang)化。可優(you)先使(shi)用(yong)(yong) 0.1?Immol/L 的二硫蘇糖醇，因為(wei)它(ta)不能和蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)形成分子間二硫鍵，而 2-疏基(ji)乙醇可以(yi)。溶液中應加人(ren)足(zu)夠的(de)(de)還(huan)(huan)原劑(ji)，如果(guo)還(huan)(huan)原劑(ji)過少, 蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)會在其耗盡后由于(yu)失去保(bao)護(hu)而被氧化。在某些(xie)情(qing)況(kuang)下，要加人(ren)鹽以(yi)保(bao)持一定的(de)(de)離(li)子強度(du), 但僅(jin)限于(yu)當它(ta)們與下一步的(de)(de)純化或(huo)分析步驟相兼容的(de)(de)情(qing)況(kuang)下使用。同樣,5%?20% 的(de)(de)甘(gan)油往往有助于(yu)保(bao)持穩定, 并(bing)且這些(xie)濃度(du)適用于(yu)大多數純化步驟。有時(shi)，需要加人(ren)低水平的(de)(de)非離(li)子去污劑(ji)以(yi)防止蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)聚集或(huo)吸附到所使用器材 (如玻璃器皿）的(de)(de)表面。最后，加人(ren)蛋白酶抑制劑是一個很好的(de)做(zuo)法，特別是在(zai)早期的(de)操作步(bu)驟之中(zhong)。

四、穩定性實驗和儲存條件

在(zai)(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)種新(xin)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)化過(guo)程(cheng)(cheng)中，最重要(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究之(zhi)一(yi)(yi)(yi)(yi)是(shi)(shi)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)和存儲(chu)研(yan)究。這(zhe)意(yi)味著在(zai)(zai)純(chun)(chun)化過(guo)程(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)每個(ge)步驟之(zhi)后，一(yi)(yi)(yi)(yi)定(ding)要(yao)(yao)(yao)檢測感興趣蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)和存儲(chu)性(xing)(xing)。雖然快捷的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)(chun)化過(guo)程(cheng)(cheng)是(shi)(shi)人(ren)們所期望的(de)(de)(de)(de)，但(dan)經(jing)常(chang)(chang)會發生一(yi)(yi)(yi)(yi)些意(yi)外(wai)情況，特(te)別(bie)是(shi)(shi)在(zai)(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)個(ge)新(xin)的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)化過(guo)程(cheng)(cheng)中，在(zai)(zai)進(jin)行下一(yi)(yi)(yi)(yi)個(ge)純(chun)(chun)化步驟之(zhi)前需(xu)(xu)要(yao)(yao)(yao)將(jiang)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)放置一(yi)(yi)(yi)(yi)段時(shi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)時(shi)候。為(wei)此，你(ni)需(xu)(xu)要(yao)(yao)(yao)知道它(ta)在(zai)(zai)不同儲(chu)藏條(tiao)(tiao)件(jian)下的(de)(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)。最簡單的(de)(de)(de)(de)測試辦法(fa)是(shi)(shi)取少量蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)溶液，將(jiang)它(ta)們存儲(chu)在(zai)(zai)不同的(de)(de)(de)(de)條(tiao)(tiao)件(jian)下 (如(ru)儲(chu)存于(yu)冰(bing)上、將(jiang)其冰(bing)凍或(huo)在(zai)(zai)室溫下存放，以及加人(ren)或(huo)不加人(ren)穩(wen)定(ding)劑），然后在(zai)(zai)不同的(de)(de)(de)(de)時(shi)間(jian)段檢測蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)活性(xing)(xing)。另外(wai)，要(yao)(yao)(yao)知道下一(yi)(yi)(yi)(yi)個(ge)純(chun)(chun)化步驟是(shi)(shi)什么。一(yi)(yi)(yi)(yi)些存儲(chu)條(tiao)(tiao)件(jian)對穩(wen)定(ding)很好(hao)，但(dan)不利(li)于(yu)進(jin)一(yi)(yi)(yi)(yi)步的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)化。一(yi)(yi)(yi)(yi)個(ge)恰當的(de)(de)(de)(de)例子是(shi)(shi)于(yu)一(yi)(yi)(yi)(yi) 20°C 將(jiang)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)存儲(chu)在(zai)(zai) 50% 的(de)(de)(de)(de)甘(gan)(gan)油 (V/Y) 通(tong)常(chang)(chang)是(shi)(shi)保持穩(wen)定(ding)的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)(yi)個(ge)有用(yong)(yong)(yong)條(tiao)(tiao)件(jian)，但(dan)如(ru)果(guo)你(ni)要(yao)(yao)(yao)進(jin)行進(jin)一(yi)(yi)(yi)(yi)步的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)化，這(zhe)是(shi)(shi)相當可(ke)怕的(de)(de)(de)(de)。有時(shi)可(ke)能(neng)有必(bi)要(yao)(yao)(yao)應用(yong)(yong)(yong)這(zhe)樣(yang)的(de)(de)(de)(de)程(cheng)(cheng)序，即通(tong)過(guo)透析去除甘(gan)(gan)油，但(dan)這(zhe)一(yi)(yi)(yi)(yi)般是(shi)(shi)最后采用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)解決(jue)措施。

當你完成(cheng)了純(chun)化(hua)流程并準(zhun)備長時間存儲所純(chun)化(hua)的(de)蛋白質(zhi)時，一個不同的(de)情況出現了。

在(zai)這(zhe)里, 主要(yao)關(guan)注(zhu)的(de)是蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)長期(qi)穩(wen)定(ding)(ding)性，很多在(zai)純(chun)化過程中不(bu)實(shi)用的(de)條件(jian)現在(zai)變得可(ke)用。這(zhe)些可(ke)能(neng)包括加(jia)人(ren)高濃度的(de)甘油、加(jia)人(ren)穩(wen)定(ding)(ding)性基(ji)質(zhi), 甚至加(jia)入其(qi)他(ta)(ta)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi) (如血清白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)）。儲(chu)存條件(jian)的(de)選擇取決(jue)于什么對蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)穩(wen)定(ding)(ding)是有效的(de)，以及純(chun)化的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)將(jiang)要(yao)作(zuo)何(he)用。如果你主要(yao)的(de)興趣(qu)是研(yan)究酶的(de)活性，那么血清白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)存在(zai)可(ke)能(neng)無關(guan)緊要(yao)。相比之下，如果你想要(yao)研(yan)究蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)結(jie)構，那么就不(bu)希望有其(qi)他(ta)(ta)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)存在(zai)。如果你不(bu)確定(ding)(ding)，最好是將(jiang)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)分裝(zhuang)并存儲(chu)在(zai)不(bu)同的(de)條件(jian)下。

蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)存(cun)儲(chu)(chu)的(de)(de)相關問題還(huan)有純(chun)化蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液的(de)(de)凍融(rong)。避免(mian)反復凍融(rong)的(de)(de)一種(zhong)方式是將純(chun)化的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)分裝成(cheng)小(xiao)份(fen)，每次按需取(qu)出其中(zhong)的(de)(de)一份(fen)或幾份(fen)融(rong)解; 另外，將蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)存(cun)儲(chu)(chu)在(zai)非凍結的(de)(de)條(tiao)(tiao)件下(xia)，如(ru)一 2 〇°C 條(tiao)(tiao)件下(xia) 50% 的(de)(de)甘油中(zhong)。如(ru)果(guo)需要反復凍融(rong), 最好是使用(yong)快(kuai)速(su)的(de)(de)凍融(rong)程序。在(zai)冷凍過(guo)程中(zhong)，溶(rong)質(zhi)濃縮(suo), 蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)可(ke)能會暴露于(yu)異常惡劣的(de)(de)條(tiao)(tiao)件中(zhong)。我們通常將蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)速(su)凍于(yu)干冰-乙醇浴以(yi)避免(mian)這個問題。同(tong)樣，對(dui)解凍蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液也應(ying)該快(kuai)速(su)地進行(xing)，將其置于(yu)緩慢攪拌(ban)的(de)(de)溫(wen)水浴中(zhong)，直(zhi)到樣品(pin)溶(rong)解到僅剩(sheng)少量(liang)的(de)(de)冰塊時取(qu)出。在(zai)使用(yong)過(guo)程中(zhong), 溶(rong)液解凍后(hou)放置于(yu)冰上或室溫(wen)條(tiao)(tiao)件下(xia)。最后(hou)解凍的(de)(de)溶(rong)液應(ying)該輕輕地混合，如(ru)果(guo)溶(rong)液在(zai)管中(zhong)可(ke)以(yi)顛倒，以(yi)確保溶(rong)質(zhi)均(jun)勻分布(bu)。

五、蛋白質水解和蛋白酶抑制劑

蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)水(shui)解(jie)是(shi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)(chun)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)一(yi)個主要(yao)問題。因為(wei)在(zai)(zai)(zai)(zai)很多情(qing)況下目(mu)標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)(zai)(zai)(zai)部(bu)分(fen)降(jiang)解(jie)時仍能(neng)保(bao)留生物(wu)活(huo)性，所(suo)(suo)以這(zhe)是(shi)一(yi)個特(te)別潛在(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)問題。而且這(zhe)一(yi)現(xian)(xian)象這(zhe)可(ke)(ke)能(neng)會導(dao)致在(zai)(zai)(zai)(zai)進行蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)大(da)小和結(jie)(jie)構分(fen)析(xi)時得(de)出錯誤的(de)(de)(de)結(jie)(jie)論。蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)水(shui)解(jie)可(ke)(ke)能(neng)出現(xian)(xian)在(zai)(zai)(zai)(zai)純(chun)(chun)化(hua)(hua)過(guo)程的(de)(de)(de)任何階段(duan)。因為(wei)純(chun)(chun)化(hua)(hua)過(guo)程總是(shi)趨向于消除這(zhe)些具有(you)水(shui)解(jie)活(huo)性的(de)(de)(de)污染(ran)物(wu), 所(suo)(suo)以一(yi)般(ban)來說總的(de)(de)(de)水(shui)解(jie)活(huo)性在(zai)(zai)(zai)(zai)初始(shi)的(de)(de)(de)粗提(ti)取物(wu)中(zhong)(zhong)是(shi)最高的(de)(de)(de)。然而，粗提(ti)物(wu)中(zhong)(zhong)也(ye)存在(zai)(zai)(zai)(zai)著很多可(ke)(ke)能(neng)會保(bao)護(hu)目(mu)標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。在(zai)(zai)(zai)(zai)純(chun)(chun)化(hua)(hua)過(guo)程中(zhong)(zhong), 一(yi)種蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶微量的(de)(de)(de)污染(ran)甚(shen)至會產(chan)生很大(da)的(de)(de)(de)影(ying)響，因為(wei)大(da)部(bu)分(fen)可(ke)(ke)接(jie)觸的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)底(di)物(wu)可(ke)(ke)能(neng)都是(shi)你所(suo)(suo)需(xu)的(de)(de)(de)目(mu)標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。

如果(guo)在特定的(de)情況下蛋白(bai)質水解是(shi)一(yi)個問(wen)題(ti)，你怎么判斷呢？最簡單的(de)測(ce)試方法是(shi)將(jiang)提(ti)取(qu)物或部(bu)分(fen)(fen)純(chun)化的(de)蛋白(bai)質在溫(wen)和的(de)溫(wen)度下孵育(yu) (如 30°C)，分(fen)(fen)時間段取(qu)出部(bu)分(fen)(fen)樣品(pin)進行(xing)生(sheng)物活性(xing)的(de)分(fen)(fen)析。雖然這種方法并非萬無一(yi)失(shi)(shi)，因(yin)為(wei)可(ke)能(neng)會(hui)(hui)有其他原因(yin)導致蛋白(bai)質失(shi)(shi)活，但(dan)大多數蛋白(bai)質在這樣的(de)條件(jian)下不會(hui)(hui)熱失(shi)(shi)活。如果(guo)活性(xing)喪失(shi)(shi)，建議(yi)添(tian)加蛋白(bai)酶抑制劑，因(yin)為(wei)在純(chun)化過程中即(ji)使(shi)是(shi)將(jiang)蛋白(bai)質保持在 0?4°C 的(de)條件(jian)下也會(hui)(hui)發(fa)生(sheng)一(yi)些(xie)裂解，除非蛋白(bai)酶滅(mie)活。

細胞(bao)中含有多種(zhong)不同的蛋白酶類。幸運(yun)的是，可(ke)用蛋白酶抑制劑(ji)作用于各種(zhong)蛋白酶。

蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)用于(yu)特定(ding)(ding)的(de)(de)(de)情況或系統在本書其他章(zhang)節中有所描述。對于(yu)一個新的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)最好的(de)(de)(de)辦法(fa)是(shi)(shi)(shi)(shi)使(shi)(shi)用混(hun)合的(de)(de)(de)能夠對不(bu)同種類蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)起(qi)作用的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)。這些蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)混(hun)合物是(shi)(shi)(shi)(shi)可以(yi)買到(dao)的(de)(de)(de)。一旦獲得了保持目標(biao)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)的(de)(de)(de)條件, 可以(yi)將蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)逐(zhu)一去(qu)除以(yi)確定(ding)(ding)哪(na)一個蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)是(shi)(shi)(shi)(shi)必需的(de)(de)(de)。將會涉及一些反復(fu)實驗(yan), 以(yi)便確定(ding)(ding)哪(na)些抑(yi)制(zhi)劑(ji)是(shi)(shi)(shi)(shi)純化過程所需要(yao)的(de)(de)(de)而哪(na)些則不(bu)是(shi)(shi)(shi)(shi)。請注意(yi)，蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)在一定(ding)(ding)條件下是(shi)(shi)(shi)(shi)有毒的(de)(de)(de)和/或不(bu)穩(wen)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)。在沒有研(yan)究清楚(chu)它們的(de)(de)(de)性(xing)質(zhi)(zhi)之前請不(bu)要(yao)使(shi)(shi)用。

六、蛋白質活性丟失

在蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質純化(hua)過(guo)程(cheng)中(zhong)通(tong)常聽到的(de)(de)(de)哀嘆是:「我(wo)的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質失去(qu)了(le)活(huo)(huo)性。」當這種情(qing)(qing)況發生時，需要仔細分析情(qing)(qing)況，以查明原(yuan)因(yin)。最(zui)重要的(de)(de)(de)是，你應該仔細計算酶單位，以評估活(huo)(huo)力損(sun)(sun)失的(de)(de)(de)程(cheng)度。對(dui)于許多純化(hua)步驟，損(sun)(sun)失高達 50% 的(de)(de)(de)比例(li)是正常的(de)(de)(de)，當然，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質活(huo)(huo)性損(sun)(sun)失的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況對(dui)每個(ge)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質是不一(yi)樣的(de)(de)(de)。一(yi)般來說，包含有將蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質與基質結(jie)(jie)合(he), 并(bing)且在結(jie)(jie)合(he)的(de)(de)(de)過(guo)程(cheng)中(zhong)可能需要發生構象(xiang)變化(hua)的(de)(de)(de)純化(hua)步驟相比于凝膠過(guo)濾來說對(dui)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質活(huo)(huo)性的(de)(de)(de)影響更(geng)大。

如果在(zai)某一(yi)個純化步驟蛋白質的(de)活性完全喪失(shi)，需(xu)要(yao)(yao)考(kao)慮其(qi)他的(de)可(ke)能(neng)性。第一(yi)種可(ke)能(neng)是在(zai)某些情(qing)況下(xia), 蛋白質可(ke)能(neng)與層(ceng)析柱(zhu)結合(he)得非常緊密，需(xu)要(yao)(yao)使用更加極端的(de)洗脫程序。根據層(ceng)析的(de)類型(xing) (見本書第 6 部分(fen)和第 7 部分(fen))，可(ke)能(neng)需(xu)要(yao)(yao)增加離子強度、使用一(yi)個離液(ye)序列比較高(gao)的(de)鹽 (如 KBr)，或(huo)在(zai)洗脫液(ye)中加入去污劑或(huo)乙二醇(chun)。

第(di)二種(zhong)可能是蛋白質活(huo)性(xing)的(de)(de)發揮需要(yao)多個(ge)(ge)組(zu)(zu)(zu)分, 這些(xie)(xie)組(zu)(zu)(zu)分 (如另一(yi)個(ge)(ge)亞基或(huo)輔因子）在(zai)分級分離過程中(zhong)被除去(qu)(qu)了(le)(le)。因此，無(wu)論哪一(yi)種(zhong)組(zu)(zu)(zu)分其本(ben)身(shen)是無(wu)活(huo)性(xing)的(de)(de)，只有(you)(you)在(zai)所(suo)有(you)(you)組(zu)(zu)(zu)分出(chu)現時才可觀察(cha)到活(huo)性(xing)。為了(le)(le)測(ce)(ce)試這種(zhong)可能性(xing)，可將前一(yi)步中(zhong)的(de)(de)所(suo)有(you)(you)組(zu)(zu)(zu)分混(hun)合到一(yi)起(qi)，再檢(jian)測(ce)(ce)其活(huo)性(xing)。在(zai)某(mou)些(xie)(xie)情(qing)況下, 有(you)(you)必要(yao)將混(hun)合物濃縮到原來的(de)(de)體(ti)積(ji)去(qu)(qu)觀察(cha)其活(huo)性(xing)。如果混(hun)合所(suo)有(you)(you)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)分后再次檢(jian)測(ce)(ce)到了(le)(le)活(huo)性(xing)，則(ze)應該(gai)以配對的(de)(de)方式檢(jian)測(ce)(ce)這些(xie)(xie)組(zu)(zu)(zu)分或(huo)組(zu)(zu)(zu)分群。經(jing)常會發現某(mou)個(ge)(ge)組(zu)(zu)(zu)分有(you)(you)微量(liang)的(de)(de)活(huo)性(xing)而需要(yao)第(di)二種(zhong)組(zu)(zu)(zu)分以達(da)到最佳的(de)(de)活(huo)性(xing)。此時，所(suo)需要(yao)的(de)(de)一(yi)種(zhong)組(zu)(zu)(zu)分已經(jing)很(hen)明確(que)了(le)(le)，而其他(ta)組(zu)(zu)(zu)分可以通過測(ce)(ce)試其刺激活(huo)性(xing)來確(que)定。

有時在純化步(bu)驟之間蛋(dan)白質可能會喪(sang)失活(huo)性，如在透析或濃縮過程中(zhong)，或甚至在存儲過程中。對于(yu)前者，你(ni)應該再次檢測除(chu)去一種可能需要的(de)(de)組分所(suo)產生的(de)(de)結果。也有(you)這樣(yang)的(de)(de)可能性, 就是蛋白質依附在透析管(guan)或濃縮膜上。對此(ci)，用含(han)有(you)一定去污劑的(de)(de)緩沖液沖洗這些管(guan)或膜可能會有(you)所(suo)幫助。存儲過(guo)程中的(de)(de)穩定性問題在上面已經有(you)所(suo)討論。

最令人沮喪的情(qing)況(kuang)是(shi)(shi)以上所有(you)的可能(neng)性(xing)中沒有(you)一種是(shi)(shi)蛋白(bai)質(zhi)失活的原因(yin)。在這種情(qing)況(kuang)下, 最可能(neng)的解釋(shi)是(shi)(shi)蛋白(bai)質(zhi)因變性、水解等確實(shi)失(shi)活了。如(ru)果可(ke)以獨立檢測(ce)蛋白(bai)質 (如(ru) WesternBlot 法(fa)），這種(zhong)情(qing)況可(ke)以直接顯示。如(ru)果不行，可(ke)能需要進行反(fan)復實(shi)驗 (trialanderrorexperiment) 檢測(ce)各種(zhong)條件來尋找失(shi)活的原因(yin)。有時(shi)，最(zui)好(hao)的辦法(fa)是避免特殊的純化步驟。

少量純化 (低于(yu)毫克級(ji)蛋白(bai)(bai)質(zhi)量的(de)(de)純化) 的(de)(de)操(cao)作要注意一系列(lie)特殊問題。尤(you)其是要特別注意蛋白(bai)(bai)質(zhi)因(yin)吸附于(yu)各(ge)種表(biao)(biao)面(mian)而(er)損失(shi)的(de)(de)可能性。少量蛋白(bai)(bai)質(zhi)與某些表(biao)(biao)面(mian)結(jie)合(he)緊密，如玻璃表(biao)(biao)面(mian)和(he)多種塑料表(biao)(biao)面(mian)，常常會高達 Iyg/cm2。在少量蛋白(bai)(bai)質(zhi)純化過程中(zhong)(zhong)，由于(yu)蛋白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)總量本來就(jiu)很少，所以(yi)這(zhe)(zhe)些因(yin)吸附而(er)損失(shi)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)量可占到(dao)相當(dang)(dang)大的(de)(de)比(bi)例。當(dang)(dang)然，你應該(gai)避免使用聚(ju)苯乙(yi)烯材料制成的(de)(de)容器 (如微量滴定盤），因(yin)為它具(ju)有(you)較高的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)結(jie)合(he)能力(li)。在這(zhe)(zhe)樣的(de)(de)情況(kuang)下，管道應仔細地(di)沖洗以(yi)確保蛋白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)最大回收率(lv)。此外，低濃度(du)非(fei)離子型(xing)去污劑的(de)(de)存在可能有(you)助于(yu)防止蛋白(bai)(bai)質(zhi)與表(biao)(biao)面(mian)結(jie)合(he)。在整個過程中(zhong)(zhong)，小(xiao)心地(di)計算(suan)蛋白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)量是相當(dang)(dang)重要的(de)(de)，這(zhe)(zhe)可能會提醒研究者(zhe)在哪里發生(sheng)了(le)不必要的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)損失(shi)。